[B(n)eT(t)nÄsSeR]

Hallo,
habe einige Fragen zu einem Versuch den ich im Internet gefunden habe.
Link
Mein Lehrer verlangt von mir ihm erklären zu können welcher Schritt was bewirkt.
Da mir Chemie Spaß macht hab ich eingewilligt und erst später gemerkt, dass mir das Thema mehr als fremd erscheint... Ich kann kaum etwas nachvollziehen bei dem Versuch ...
Deswegen wollt ich mal fragen, ob mir jemand von euch vielleicht weiterhelfen kann, der sich mit dem Thema auskennt.
MfG

[DKind]

Da wir selbst schonmal einen ähnlichen Versuchen in der Stufe 10 durchgeführt haben, versuchte ich dir mal zumindestens den Einsatz der verschiedenen Stoffe zu erklären.

Um die DNA aus dem Zellkern bzw der Zelle herauszulösen, muss man zuerst die Zellmembran (welche aus Lipiddoppelschichten besteht) mit Spülmittel (Detergenzien)"aufbrechen"
Durch die Proteaselösungn (Protean in jedem Waschmittel enthalten -> Enzyme) werden dann die Zellproteine abgebaut, sodass nur noch die DNA übrig bleibt.
Damit man im Verlauf die DNA sichtbar machen kann, muss man den Spiritus (Ethanol) dazugeben.
Da sich dann die DNA nicht im Alkohol löst, setzt sie sich als "Brocken" ab.
Mit dem Mörser wurde natürlich vorher die Zellwand zerstört.

Dieser Beitrag wurde von DKind bearbeitet: 22. Januar 2008 - 18:30

[B(n)eT(t)nÄsSeR]

ah besten Dank. Wie schauts aber mit dem eiskalten Alkohol aus und dem starken erwärmen und dem starken abkühlen hinterher?
MfG

[DKind]

Mhh, tut mir leid, aber dazu kann ich dir jetzt leider keine genaue Antwort geben.

Ich weiß halt nur, dass der Lösungsvorgang bei wärme "beschleunigt" wird
Aber das sollte eigentlich jedem Chemiker klar sein

[B(n)eT(t)nÄsSeR]

Zitat (DKind: 22.01.2008, 20:43)

Mhh, tut mir leid, aber dazu kann ich dir jetzt leider keine genaue Antwort geben.

Ich weiß halt nur, dass der Lösungsvorgang bei wärme "beschleunigt" wird
Aber das sollte eigentlich jedem Chemiker klar sein

es wird ja nicht nur stark erwärmt, sondern auch stark (eiskalter alkohol(!)) abgekühlt. dieser effekt ist momentan noch das ding das mich grübeln lässt.
Ich vermute ja, dass es etwas mit der Löslichkeit zu tun hat ...

MfG

[B(n)eT(t)nÄsSeR]

Hätte von euch noch jemand ne Idee, was es mit dem eiskalten Spiritus auf sich hat?
MfG

[Leshrac]

Würde dir das auch auf Englisch helfen? Ich versuche es erst einmal auf Deutsch:
Dieses "supercooling" ist dazu gedacht, eine Beschädigung/Denaturierung des extrahierten Materials zu verhindern, vor allem durch Oxydation, vor allem bei Pflanzenmaterial. Du verwendest pflanzen-DNA, dabei spielt die Oxydation die wichtigste rolle, will man z.b. aus Organen extrahieren, wird sogar auf bis zu -40C gekühlt, um auch Enzyme, die die extrahierte DNA beschädigen könnten, funktionsunfähig zu machen.

Dieser Beitrag wurde von Leshrac bearbeitet: 06. April 2008 - 21:49

[B(n)eT(t)nÄsSeR]

super. würde mir auch auf englisch weiterhelfen, wenn du noch was zu ergänzen hättest.
wozu dient z.b. der extraktionspuffer, den ich als erstes ansetz, genau?
Danke auf jeden Fall!
wär cool, wenn du mir bis heute abend noch bescheid geben könntest, da ichs wahrscheinlich morgen abgeb.
Gruß

[Leshrac]

Ok, dann übernimmt meine Frau das einmal, ich selbst kenne mich damit nämlich auch nicht aus

Hi, based on what Leshrac translated for me from that article you linked and the info you're missing, I'll start off with the buffering solution (and I'll try to keep it simple).
Usually, when you produce a raw DNA extract from organic tissue, you first create an impure mix of both the DNA and a lot of secondary substances such as proteins and fats. The buffer is merely a carrier, which purifies this solution by separating the DNA from the impurities in your solution.
After applying the buffer, you apply ethanol to precipitate the purified DNA out of the now two phased solution.
By cooling the extract, you simply ensure that the purified DNA can not be damaged by any remnant enzymes or oxidation. It also prevents any denaturation of the extract which may occur during storage. In addition you should make sure, that there are no sources of damaging radiation which the sample could be exposed to.

Good luck, Aurelie

[B(n)eT(t)nÄsSeR]

Besten Dank/Thanks a lot! - lets see how much i can keep in mind, when i have to present it tomorrow

See you!

[B(n)eT(t)nÄsSeR]

Sodele. Hat wunderbar geklappt.
Nur wusste ich leider nicht zu erklären wieso es zuerst erwärmt wurde. Meine Vermutung war, dass es nur in dem Rahmen zwischen 60°C und -x°C funktioniert, da ansonsten die Proteine denaturiert würden, oder die Reaktion nicht stattfinden kann. Zumindest die Proteaselösung. Da ich es aber nicht sicher wusste, meinte mein Lehrer soll ich nochmals nachforschen.
Wenn das nochmals direkt hierüber funktionieren würde, wär das super, ansonsten war das schon Hilfe genug =) - Danke nochmals!
Grüße
Hendrik

[Leshrac]

Well, you ought to have asked about that beforehand, huh?
Actually it`s pretty much straightforward the way you described the process. We call that stage of the extraction process incubation period, where the still intact cells of the specimen are dissolved (e.g. membranes destroyed) for the later separation of the DNA. Especially with plant tissue, it`s common practice to apply a specific protease to the crude solution to achieve this. Each has it`s own specific max efficiency temperature, but most are in the reign of 50-60C, too high a temperature will indeed result in the destruction of the protease.
By setting the exact temperature of your chosen protease you achieve the best and most efficient yield in cytolysis of crude lysate. It`s also quite easy to observe during the actual process, as soon as tissue is lysed you will notice cloudy material in your solution.
The addition of cooled or even supercooled ethanol no longer has anything to to with the lysation process, it is just the phase carrier which causes the DNA to precipitate out of the lysate by binding to the ethanol.

Well, I hope it`s not too complicated this way

[B(n)eT(t)nÄsSeR]

Thanks a lot, I just have another question. I couldn't find any translation for the following words, perhaps leshrac might translate them for me, otherwise is that one little passage a bit tricky for me to understand:
(crude) lysate
and
cytolysis

I have to present the experiment also one more time tomorrow and on friday in other classes. I hope it'll work as well as today.
Thank you very much!²

greetings from ludwigsburg

Dieser Beitrag wurde von B(n)eT(t)nÄsSeR bearbeitet: 08. April 2008 - 20:58

[Leshrac]

Tut mir leid, aber mit den deutschen Fachausdrücken kann ich da auch nicht dienen, auch ist es sehr schwer für mich, das ganze im richtig Kontext zu übersetzen, es fehlt mit leider die Übung in Deutsch in diesem Bereich und wir haben auch kein deutsches Fachwörterbuch/Thesaurus. Sonst hätte ich dir das ganze ja auch gleich auf Deutsch hier posten können
Aber lies dir dies hier doch einmal durch, dort werden alle Begriffe ganz gut erläutert. Und in einer Bibliothek findest du sicher auch ein entsprechendes fachbezogenes Wörterbuch.

[Gitarremann]

Soll ich das übersetzen oder ist die Zensur wichtig?